1 서론

꿀은 오랫동안 영양가 높고 천연적인 치료제로 인식되어 왔습니다. 꿀벌은 꽃의 화밀에서 꿀을 생산하는데, 이 화밀은 밀도가 높고 에너지가 풍부하여 관능적으로나 건강적으로도 좋은 물질입니다. 꿀의 화학적 조성과 관능적 특성은 주로 벌의 채집 행동, 화밀의 공급원, 그리고 지역적 환경 조건과 같은 요인의 영향을 받습니다. 다양한 식물의 공급원은 꿀의 풍미, 향, 그리고 색상의 다양성에 상당한 영향을 미칩니다(Vit et al.  2015 ).

꿀에는 과당과 포도당이 우세한 많은 당류와 유기산, 단백질, 항산화제, 플라보노이드, 효소, 아미노산 및 페놀성 화합물이 포함되어 있습니다(Almasaudi  2021 ; Oryan et al.  2018 ). 상처 치유 및 항산화 효과와 같은 꿀의 잘 문서화된 건강상의 이점은 복잡한 생화학적 구성에서 비롯됩니다(Erejuwa et al.  2012) . 자당, 디아스타제, 프로린 및 하이드록시메틸푸르푸랄(HMF)을 포함한 주요 성분은 꿀의 품질, 진위성 및 건강에 미치는 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다(Gheldof et al.  2002 ). 자당과 다른 당류는 혈당 수치를 모니터링하는 개인에게 중요한 혈당 지수에 영향을 미칩니다(Palma-Morales et al.  2023 ). 디아스타제 활동은 꿀의 신선도와 적절한 취급을 나타냅니다. 더 높은 수치는 최소한의 열 처리와 더 나은 효소 보존을 반영합니다. 꿀의 주요 아미노산인 프롤린은 숙성도와 진위성을 평가하는 데 널리 사용되는데, 그 농도가 꿀의 변질을 나타낼 수 있기 때문입니다(da Silva et al.  2016 ). 열과 보관 시간에 따라 증가하는 HMF(Hyper-  Methyl ...

꿀에는 곰팡이, 효모, 바실러스  종,  클로스트리디움  종, 젖산균(LAB)을  포함한 다양한 미생물이 소량으로 존재합니다  (Neveling et al. 2012 ; Vit et al.  2015 ). 특히 LAB는 꽃꿀과 꽃가루에서 영양분을 얻고 성숙한 꿀벌과 상호 작용합니다(Endo et al.  2009 ; Neveling et al.  2012 ). 이러한 미생물은 특히 탄수화물이 풍부한 환경에서 널리 퍼져 있습니다. 여러 연구에 따르면 LAB는 발효 능력 덕분에 꽃꿀을 꿀로, 꽃가루를 벌빵으로 바꾸는 발효 과정에서 중요한 역할을 한다고 합니다(Vásquez et al.  2009 ; Olofsson et al.  2016 ). 꿀에서 발견되는 미생물은 꿀벌의 소화기관과 꽃꿀, 꽃가루, 프로폴리스, 꽃가루, 벌집 환경 등의 2차적 출처와 1차적 출처 모두에서 유래합니다(Olofsson and Vásquez  2008 ).

Olofsson과 Vásquez( 2008 )는 Apis mellifera  의 꿀 위와 신선한 꿀 모두에서  Lactobacillus ,  Enterococcus 및  Bifidobacterium 의 존재를 감지했습니다  .마찬가지로 Tajabadi et al.( 2011 )은 Apis dorsata 의 꿀 위와 벌집에서 이러한 박테리아 속을 보고했습니다  .Hasali et al.( 2015 )은 말레이시아 반도의 동쪽 해안을 따라 다양한 지역에서 수집한 Meliponini 꿀에서 LAB의 5가지 균주를 분리했습니다.폴란드의 꿀 샘플을 조사한 Pajor et al.( 2018 )은 박테리아 분리주의 80.4%가 Bacillus 속에 속하며  46 가지 균주 중 37가지가 Bacillus 속으로 확인되었습니다.Feizabadi et al.( 2021 )은 Apis mellifera 에서 저장된 꿀을 조사하여  Enterococcus  와  Lactobacillus 종을  모두 성공적으로 분리했습니다   . Parichehreh et al.( 2017 ,  2018 )  의 연구에서 Lactobacillus kunkeii ,  L. plantarum ,  L. apis ,  Enterococcus faecium ,  E. faecalis 및  E. hirae 의 여러 균주가 이란의 아시아 난쟁이 꿀벌인 Apis florea  의 위에서 확인되었습니다  .

Apis florea는 흔히 아시아 난쟁이 꿀벌로 알려져 있으며, 아시아의 넓은 지역에 분포하는 야생 벌 종입니다. 분포 범위는 베트남과 중국 남동부에서 남부 히말라야와 이란 고원을 거쳐 남부 오만까지 약 7000km에 이릅니다(Hepburn et al.  2005 ). 이 넓은 지리적 분포는 A. florea 의 장내 미생물 군집의 상당한 변이에 기여할 가능성이 있으며  , 이는 다시 꿀 생산에 영향을 미칠 수 있습니다. Olofsson과 Vásquez( 2008 )의 연구에 따르면 꿀의 LAB 구성은 꽃의 공급원과 계절에 따라 현저하게 다르다는 것이 밝혀졌습니다. Parichehreh et al.( 2018 )의 최근 연구에서는 A. florea 의 위에서  Lactobacillus  와  Enterococcus 와 같은 여러 종을 성공적으로 분리하고 식별하여  이 종에 존재하는 미생물 다양성을 더욱 강조했습니다.

이란 전역의 다양한 기후 조건은 다양한 꿀 생산에 중요한 역할을 하며, 각 꿀은 관능적, 관능적, 물리화학적 특성을 가지고 있습니다. 본 연구에서는  A. florea 가 생산하는 꿀의 물리화학적 특성을 분석했습니다. 이란의 여러 지역에서 A. mellifera 의 채집 행동에 대한 광범위한 연구가 수행되었지만   , 이란 내에서 난쟁이 꿀벌인  A. florea가 생산하는 꿀의 물리화학적 특성을 다룬 과학 문헌은 제한적입니다. 더욱이 A. florea 의 박테리아 구성은   여전히 대부분 미탐사 상태입니다. 본 연구의 주요 목적은 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 이용하여  이란의 다양한 지리적 지역에서 수집한 A. florea  꿀 샘플에 존재하는 박테리아 종을 식별하고 특성화하는 것이었습니다. 또한, 본 연구는 기후 요인과 꿀의 물리화학적 특성 간의 관계를 조사하고, 꿀에 존재하는 프로바이오틱 박테리아의 다양성에 대한 기후의 영향을 조사하는 것을 목표로 했습니다.

2 재료 및 방법

이 연구에서는 이란의 남부, 남동부, 남서부 지역의 8개 지역(그림 1 ) 에서 공급된 난쟁이 꿀벌 40개 군집에서 얻은 꿀을 사용했습니다  . 샘플링은 Boushehr, Chabahar, Dezful, Iranshahr, Jahrom, Jiroft, Gachsaran, Rudan에서 무작위로 수행되었습니다. 각 군집에서 1kg의 꿀 샘플을 무균적으로 채취하여 Karaj에 있는 Razi 백신 및 혈청 연구소의 실험실로 옮겨 물리화학적 특성과 젖산 박테리아 함량을 분석했습니다. Boushehr, Dezful, Jiroft 지역에서는  Ziziphus  sp.가 우세한 꽃 공급원으로 확인되었습니다. 이와 대조적으로 Jahrom, Rudan, Iranshahr, Gachsaran, Chabahar의 꿀 샘플은  Citrus ,  Astragalus ,  Prosopis ,  Eucalyptus ,  Acacia  종을 포함한 더 다양한 식물에서 유래했습니다.

본 연구에서는 이란 여러 지역에서 생산된 꿀 샘플을 다양한 물리화학적 매개변수를 기반으로 품질을 평가했습니다. 분석에는 산도(Pascual-Mate et al.,  2018 ), pH(Pascual-Mate et al.,  2018 ), 수분 함량(Yegge et al.,  2021 ), 자당, 과당, 포도당, 프로린, 디아스타제 활성, 회분, 그리고 히드록시메틸푸르푸랄(Feás et al., 2010 ) 의 존재 여부가 포함되었습니다  .

2.1 자당, 포도당 및 과당 측정

가수분해 전후에 측정한 환원당 농도 차이에 환산 계수 0.95를 곱하여 자당 함량을 결정했습니다.

포도당 함량은 과당 대 포도당 비율을 평가하여 계산했습니다. 구체적으로, 0.1 N 요오드 용액 20 mL, 0.5 N NaHCO3 5 mL , 그리고 꿀 시료 25 mL를 혼합하여 암실에서 15분간 배양했습니다. 이후, 2 NH2SO4 5 mL를 첨가 하고 0.1  N Na2S2O3로 적정했습니다 . 포도당 농도( g )는 적정 중 티오 황산나트륨 소비량의 차이 를 기준으로 결정했습니다.

과당 함량은 가수분해 전에 측정된 총 환원당 함량에서 측정된 포도당 함량을 빼서 계산했습니다(Hadhramie et al.  2023 ).

2.2 프로린 분석

프로린 함량은 닌히드린, 포름산, 프로판올을 시약으로 사용하여 510nm에서 분광광도법으로 결정되었습니다(Sáez et al.  2004 ).

2.3 꿀 시료의 디아스타제 효소 활성 측정

꿀의 디아스타제 활성은 주로 전분을 환원당으로 가수분해하는 촉매인 디아스타제에 기인하는 효소 용량을 반영합니다. 이 활성은 샤데 방법을 사용하여 측정했습니다. 간단히 말해, 전분 표준 용액을 각 꿀 샘플에 첨가하고 40°C의 수조에서 30분 동안 배양했습니다. 배양 후, 반응 혼합물 약 1mL를 빼내고 요오드 용액 몇 방울과 섞었습니다. 파란색이 사라지면 전분이 가수분해되어 디아스타제 활성이 확인되었습니다. 파란색 강도의 감소는 660nm에서 분광 광도계로 모니터링했습니다. 시간-흡광도 곡선을 생성하고 회귀 방정식을 사용하여 흡광도 값 0.235에 도달하는 데 필요한 반응 시간( t x , 분)을 결정했습니다. 그런 다음 디아스타제 수는 디아스타제 수 = 300/ t x  (Fallico et al.  2004 ) 공식을 사용하여 계산했습니다 .

2.4 회분 함량 측정

회분 함량은 중량법을 사용하여 측정했습니다. 약 5g의 꿀을 도가니에 정확하게 계량하여 넣고 550°C의 머플로에서 6시간 동안 또는 유기물이 완전히 연소될 때까지 항량에 도달할 때까지 소각했습니다. 남은 무기 잔류물의 무게를 측정하고, 회분 함량을 초기 시료 무게의 백분율로 계산했습니다. 이 절차는 국제꿀위원회(International Honey Commission, Bogdanov,  2002 )의 지침에 따라 수행되었습니다.

2.5 히드록시메틸 푸르푸랄(HMF)의 측정

히드록시메틸푸르푸랄(HMF) 함량은 분광광도법을 사용하여 측정하였다. 시료는 먼저 카레즈 용액 I(증류수 100mL 에 녹인 K4Fe (CN) 6 ·3H2O 15g )과 카레즈 용액 II(증류수 100mL에 녹인 Zn(CH3COO)2·2H2O 30g)로 처리 하였다 . 이후 , 대조군 에는 0.2% 중아황산나트륨을 첨가하고, 꿀 시료에는 증류수를 첨가하였다. 대조군에 대한 흡광도는 284nm와 336nm에서 측정하였다. HMF 농도는 284nm에서의 흡광도에서 336nm에서의 흡광도를 빼서 계산하였다(Ananias et al.  2013 ).

2.6 배양 방법

유산균(LAB)을 분리하기 위해, 멸균 생리식염수에 10%(w/v) 꿀 용액을 제조하고 유산균 성장을 촉진하기 위해 MRS 한천배지(de Man, Rogosa, and Sharpe; Oxoid)에 도말하였다. 접종된 배지는 Tajabadi et al.(2011 ) 의 프로토콜에 따라 혐기성 용기(Merck, Darmstadt, Germany)에서 Anaerocult A 가스 팩을 사용하여 37°C에서 3~4일 동안 혐기성 조건에서 배양하였다. 순수한 배양액을 얻기 위해, 뚜렷한 형태적 특징을 보이는 100개의 콜로니를 선별하여 추가 계대배양하였다.

2.7 생화학적 스크리닝

초기 스크리닝은 Coeuret et al.( 2004 ) 이 정립한 기준에 따라 그람 양성 및 카탈라아제 음성 특성을 보이는 LAB 균주를 식별하는 것을 목표로 했습니다 . 장기 보관을 위해 선별된 균주는 Feizabadi et al.( 2021 ) 이 기술한 프로토콜에 따라 15%(v/v) 글리세롤이 보충된 MRS 배지에 -18°C에서 보관하여 후속 분석을 수행했습니다.

2.8 DNA 추출

게놈 DNA는 Ward( 1994 ) 가 처음 기술한 수정된 방법과 함께 QIA Gene 키트 프로토콜을 사용하여 추출했습니다 . DNA 샘플은 150 μL의 이중 증류수에 용해하여 보관했습니다. 24°C. 추출된 DNA의 품질은 1% 아가로스 겔 전기영동으로 평가하였고, DNA 순도는 260nm와 280nm에서 흡광도를 측정하여 분광광도법으로 결정하였다.

2.9 PCR