배경

진드기  Varroa destructor  는 서부 꿀벌( Apis mellifera )의 가장 심각한 해충이며, 전 세계적 군집 감소의 주요 요인입니다. 화학 살충제와 같은 전통적인 방제 방법은 빠르고 일시적으로 효과적이지만, 벌집 제품에 잔류물을 남겨 벌과 운영자의 건강에 해를 끼치고, 병원균 저항성과 확산을 촉진합니다. 지속 가능한 대안으로서, RNA 간섭(RNAi) 기술은 실험실 분석에서 꿀벌 해충 방제에 큰 잠재력을 보여주었지만, 현장에서의 효과에 대한 증거는 부족했습니다.

행동 양식

우리는 V. destructor  아세틸-CoA 카르복실화효소, Na + /K + ATPase 및 엔도키티나제 유전자를 표적으로 하는 dsRNA 혼합물과 꿀벌 식단을 통합하여 자연 양봉 조건에서 꿀벌 건강을 개선하는 RNAi 치료의 효능과 타당성을   조사했습니다.

결과

처리된 벌집에서, 우리는 포레틱 Varroa 진드기 의 평균 감염률이   각각 자당과 GFP-dsRNA를 먹인 대조 벌에 비해 33%와 42% 감소한 것을 관찰했습니다. dsRNA 처리가 벌의 생존에 영향을 미치지 않았고, 이 프로젝트에 참여한 양봉가들은 이 방법이 양봉장에서 관리 가능하고 생산 활동에 방해가 되지 않는다는 것을 발견했습니다.

결론

우리의 연구 결과는 자연 사육 조건에서 Varroa 진드기 감염을 줄이는 데 RNAi 기술이 실현 가능하고 효과적임을 보여줍니다  . 이 연구는 RNAi가 화학 살충제에 대한 유망한 대안으로서  꿀벌 개체군에서 V. destructor를  관리하기 위한 목표 지향적이고 효율적이며 지속 가능한 솔루션을 제공할 수 있는 잠재력을 뒷받침합니다  .

그래픽 요약

체외기생성 진드기  Varroa destructor 는 전 세계적으로  서부 꿀벌인  Apis mellifera 에게 가장 심각한 해충입니다 . 다른 병원체나 기생충은 이 종에 이와 비슷한 영향을 미치지 못했는데, 그 이유는  V. destructor가  최근에야 원래 숙주인 아시아 꿀벌  Apis cerana 에서 적응하여 선천적 방어력이 매우 제한적인 새로운 숙주를 이용하기 시작했기 때문입니다.  A. cerana  군집  에서 발생하는 것과는 달리 A. mellifera 에서는  기생충이 수컷 벌과 더 끈기 있는 일벌 벌을 모두 기생시켜 더 높은 수준의 기생을 유발합니다[ 1 ]. 이 진드기는 분산기에는 성충 벌의 지방질을 먹고 생식기에는 주로 성충 전 단계의 벌의 혈림프를 먹습니다[ 2 ]. 이것은 부화하는 벌의 체중 감소, 수컷 벌의 정자 생산 감소, 채집벌의 비행, 귀환 및 방향 능력 변화, 꿀벌 면역 반응의 다운레귤레이션과 같은 여러 가지 부상을 유발합니다[ 3 ].  Varroa destructor  는 또한 바이러스 저장고이며 변형 날개 바이러스(DWV)와 같은 일부 꿀벌 관련 바이러스의 주요 매개체입니다. 벌 바이러스는 일반적으로 명백한 감염으로 지속되지만 특정 스트레스 조건에서는 개별 벌에게 심각하거나 치명적인 질병을 일으키거나 전체 군집을 붕괴시킬 수 있습니다(예: [ 4 ]).

또한 여러 연구에 따르면  V. destructor는  환경 요인, 다른 기생충 및 살충제와 같은 다른 생물학적 및 비생물학적 스트레스 요인과 상호 작용하여 꿀벌 건강에 훨씬 더 심각한 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌습니다[ 5 , 6 , 7 ]. 따라서  V. destructor  는 생산량 부족과 치료에 필요한 비용 증가로 인해 양봉 부문에서 상당한 경제적 손실을 초래하여 전 세계적으로 꿀벌 군집 감소의 주요 원인으로 간주됩니다[ 8 ]. 진드기 개체군이 발견되지 않고 치료되지 않으면 감염된 꿀벌 군집은 보통 1~3년 이내에 붕괴됩니다[ 1 ,  9 ].

진드기 감염을 치료하기 위해 양봉가들은 일반적으로 사용하기 쉽고 빠르며 일반적으로 매우 효과적이기 때문에 포름아미딘, 유기인산염 및 피레트로이드와 같은 합성 살진드기제에 주로 의존해 왔습니다.그러나 최근 이러한 살진드기제의 광범위한 사용으로 인해 효과가 감소하여 여러 국가의 양봉장에서 진드기의 내성이 진화하게 되었습니다[ 10 ,  11 ].또한 이러한 살진드기제는 밀랍, 벌빵 및 꿀에 축적되는 잔류물을 생성하며, 이것이 새끼 꿀벌과 성충 꿀벌로 옮겨져 집단의 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다[ 12 , 13 , 14 ].

합성 살진드기가 전 세계적으로 벌과 벌 제품에 미치는 부정적인 영향으로 인해 양봉가들은 일반적으로 합성 살진드기 처리에 비해 덜 효율적이지만 여전히 진드기 개체군을 효과적으로 제어할 수 있는 에센셜 오일과 유기산과 같은 비경성 화학적 제어 방법을 점점 더 많이 사용하고 있습니다[ 15 ]. 유기산은 벌 제품에서 자연적으로 발견되며 진드기에서 내성을 유발할 위험이 낮지만[ 16 ] 일벌 개체군 감소, 캡이 있는 새끼 제거 증가 또는 드론 정자 품질 감소와 같이 벌에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다[ 17 ].

지속 가능한 식량 시스템으로의 유럽 전환을 가속화하는 것을 목표로 하는 전략인 "농장에서 식탁까지" 이니셔티브에 명시된 대로, 유럽 위원회는 2030년까지 합성 살충제의 전반적인 사용과 그에 따른 위험을 50%까지 줄이는 조치를 채택했으며, 동시에 기생충과 질병으로부터 보호하는 대체 방법의 사용을 확대하도록 장려했습니다(European Green Deal 2020). 따라서  내성 진드기 집단을 생성하지 않고 꿀벌, 꿀벌 제품, 양봉가 및 환경에 안전한 V. destructor를 치료하는 대체 방법을 개발하는 것이 중요합니다  .

진핵생물 전체에서 보존된 서열 특이적 유전자 침묵의 세포 내 메커니즘인 RNA 간섭(RNAi) 활용은 특히 농업에서 표적화되고 지속 가능한 해충 방제 전략으로 제안되었습니다[ 18 ]. 병원균 또는 해충 방제를 위한 RNAi 기반 기술은 이 경로를 이용하여 표적 생물체의 생존 또는 번식에 중요한 단백질을 인코딩하는 mRNA 전사본에 보완적인 서열 특이적 dsRNA를 전달하여 특정 유전자 전사본의 발현을 억제합니다[ 19 ]. dsRNA는 서열에 따라 작용하는 방식이기 때문에 다른 기존 농약에 비해 더 선택적이고 효율적이며 유연하기 때문에 합성 살충제의 잠재적인 대안으로 부상하고 있습니다. 게다가 dsRNA는 일반적으로 토양, 퇴적물 및 물에서 환경 지속성이 제한적이며 인간의 건강에 영향을 미치지 않습니다[ 20 ,  21 ].

지난 10년 동안 연구에서는 DWV [ 22 ,  23 ], 이스라엘 급성 마비 바이러스(IAPV; [ 24 ,  25 ]) 및 Sacbrood 바이러스(SBV; [ 26 ,  27 ]), 미포자충류인  Vairimorpha ceranae  (이전에는  Nosema ceranae ; [ 28 ,  29 ]) 및 작은 벌집 딱정벌레  Aethina tumida  [ 30 ]와 같은 바이러스를 포함한 여러 일반적인 꿀벌 병원균 및 기생충을 제어하는 ​​데 RNAi의 효능을 탐구했습니다.

V. destructor 에 대한 실험실 연구에   따르면 dsRNA를 주입하거나 진드기를 dsRNA 용액에 담그면 상당한 유전자 침묵이 발생할 수 있지만 효능은 표적 유전자에 따라 다릅니다[ 31 , 32 , 33 ]. 대안으로, 진드기 유전자를 표적으로 하는 dsRNA가 보충된 시럽을 꿀벌에게 먹이면 진드기가 효과적으로 흡수하여 생존율[ 34 ]이나 번식력이 감소했습니다[ 35 ]. 최근 꿀벌 장의 공생 박테리아를 조작하여  V. destructor  대사에 필수적인 유전자에 대한 dsRNA를 반복적으로 생성하고 꿀벌에게 성공적으로 먹였습니다. 조작된 박테리아를 먹은 꿀벌의 진드기는 대조군 꿀벌을 먹은 진드기에 비해 생존율이 낮았습니다[ 23 ].

이러한 유망한 결과는 모두 통제된 조건에서 얻어졌지만, 현장 시험은 수행되지 않았습니다. dsRNA 효과를 격리하여 소규모로 테스트하는 실험실 실험과 달리, 야외 환경은 대체로 예측 불가능하고 매우 역동적인 물리적 및 생물학적 매개변수를 나타냅니다.

우리는 자연 양봉 관리 하에서 벌 건강을 개선하기 위한 RNAi 치료의 효율성과 타당성을 조사했습니다. 우리는 서부 꿀벌 식단을  V. destructor  유전자 서열에 대한 dsRNA와 통합하여 이것이 현장 조건에서 기생충 부하를 줄이는지 확인했습니다.

이 연구는 베네토 지역 2014-2020 농촌 개발 프로그램(Measure 16)에서 자금을 지원한 "BeeOShield" 프로젝트의 일부입니다. 이 프로젝트는 회원국, 그리고 이 경우 개별 이탈리아 지역이 농업 및 임업 관련 활동에서 혁신을 확대할 수 있도록 지원하는 유럽 연합의 도구입니다. 구체적으로 Measure 16에 따라 자금을 지원받은 프로젝트는 이해 관계자와 협력하여 개발될 농업 및 임업 관행에 대한 즉각적인 후속 조치를 목표로 하는 실험 연구가 될 것으로 예상됩니다. 이는 특히 유럽에서 이 분야의 연구자와 실무자 간의 효과적인 상호 작용이 부족하여 생산적이지 못한 상황을 메워야 할 필요성에서 비롯되었습니다.

이러한 맥락에서 우리는 실험에 참여하는 양봉장을 관리하는 양봉가들과 함께 프로젝트를 개발하고, 실험 프로토콜을 그들의 생산 요구에 맞게 조정하고, dsRNA 투여에 직접 참여시키고, 그들의 피드백과 제안을 수집했습니다. 이러한 접근 방식은 데이터 수집에 몇 가지 제한을 가했음에도 불구하고(예를 들어, 포레틱 감염 수준만 직접 측정할 수 있음, 아래 참조)  Varroa  진드기 방제에 대한 RNAi 기반 기술을 실험실에서 현장으로 전환하는 것의 타당성을 평가할 수 있었습니다. 현재 작업의 긍정적인 결과는 예비적이기는 하지만 꿀벌 관리 기술을 더욱 개발하고 개선하도록 격려합니다.

표적 유전자 선택 및 dsRNA 합성

억제할 유전자는 유전자 기능을 억제하여 진드기의 생존을 감소시키는 살진드기 화합물의 표적 중에서 선택되었습니다.

아세틸-CoA-카복실화효소(ACC)는 지방산 대사에서 기본적인 역할을 하는 효소입니다. 테트론산/테트라민산 계열의 살진드기제는 ACC가 카복실트랜스퍼라제 도메인에 결합하는 것을 억제하여 곤충과 진드기의 지질 생합성을 방해합니다[ 36 ].

Na + /K +  ATPase는 막투과성과 삼투압 균형 조절에 중요한 역할을 하는 이온 수송을 담당하는 막결합 효소입니다. 이 ATPase는 곤충과 진드기에 강한 독성을 나타내는 피레트린과 심장 배당체와 같은 식물이 생성하는 일부 방어 화합물의 표적입니다[